Етапи на изолиране на чиста аеробна микробиологична култура. Характеристики и принципи на изолиране на чисти бактериални култури. Борба с холерата
Чиста култура на микроорганизмае популация от клетки от един и същи вид, отглеждани върху стерилна хранителна среда. Чистата култура се изолира чрез получаване на потомството на една родителска клетка. Културата може да расте под формата на отделни колонии върху твърда хранителна среда.
Методи за изолиране на чисти култури от аеробни микроорганизми.
Всички методи за изолиране на чисти култури от микробни смеси могат да бъдат разделени на 2 групи:
Методи, базирани на принципа на механичното отделяне на микроорганизми;
Методи, базирани на биологичните свойства на микроорганизмите.
Методи, базирани на принципите на механичното разделяне на микроорганизмите
Пресяване с шпатула по Дригалски
Вземете 3 петриеви панички с хранителна среда. Капка от тестовия материал се нанася върху първата чаша с примка или пипета и се втрива с шпатула по цялата повърхност на агара. След това шпатулата се прехвърля във втората чаша и останалата върху шпатулата култура се втрива в повърхността на хранителната среда. След това шпатулата се прехвърля в третото петриево блюдо и инокулацията се извършва по същия начин. На първата плоча расте максималният брой колонии (солиден растеж), на третата - минималният брой под формата на отделно разположени колонии.
Метод на инсулт при изтощение
За да спестите медия и прибори, можете да използвате една чаша, като я разделите на 4 сектора и последователно я засявате с жилка. За да направите това, вземете материала с примка и начертайте поредица от успоредни щрихи на разстояние 5 mm един от друг, първо по повърхността на първия сектор, а след това последователно посейте всички останали сектори, като клетките остават на примката . С всеки следващ удар броят на засадените клетки намалява. След пресяване съдовете се обръщат с главата надолу, така че кондензираната вода, образувана върху капака на петриевото блюдо, да не пречи на получаването на изолирани колонии. Чашите се държат в термостат 1-7 дни, тъй като скоростта на растеж на различните микроорганизми не е еднаква.
Така в първите сектори се получава непрекъснат растеж, а по протежение на следващите удари растат изолирани колонии, представляващи потомството на една клетка.
Метод на загряване
Позволява ви да отделите спорообразуващите бацили от неспоровите форми. Загрейте тестовия материал на водна баня при 80°C за 10-15 минути. В този случай вегетативните форми умират, а спорите се запазват и, когато се засяват върху подходяща хранителна среда, покълват, образувайки колонии само от спорообразуващи бактерии.
Метод на обогатяване
Изследваният материал се инокулира върху селективни хранителни среди, които насърчават растежа на определен вид микроорганизми.
Метод за заразяване на лабораторни животни
Този метод се използва за изолиране на чиста култура от патологичен материал, замърсен с чужда микрофлора, или в случай, че има много малко патогенни микроорганизми в изследвания материал.
За инфекция се избират животинските видове, които са най-податливи на предполагаемия патоген.
Например, за да се изолира пневмокок от храчки, се заразява бяла мишка. Това животно е много чувствително към този микроб и устойчиво към други микроби, открити в храчките. В тази връзка пневмококът бързо се размножава в тялото на мишката и други микроби умират. 18-20 часа след заразяването, мишката се умъртвява и кръвта, взета от сърцето, се инокулира върху хранителна среда. Тъй като кръвта съдържа един пневмокок, върху хранителната среда расте чиста култура.
Методи, базирани на биологичните свойства на микроорганизмите
Биологичните методи за изолиране на чисти култури се основават на отчитане на едно или друго свойство на изолирания микроб, което го отличава от другите, които се смесват с него.
Метод на Шукевич
Използва се за изолиране на подвижни микроорганизми. Тестовият материал се инокулира в кондензираната вода на наклонен агар, разположен в епруветка. По време на размножаването мобилните форми на микроби от кондензационната вода се разпространяват в целия агар, сякаш „пълзят“ по повърхността му. От горната част на растежа прясна хранителна среда се засява в кондензационна вода. Чрез извършване на няколко субкултури по този начин в крайна сметка се получава чиста култура от подвижни бактерии.
Метод на инхибиране
Въз основа на различните ефекти на определени химикали и антибиотици върху микроорганизмите. Някои вещества потискат растежа на някои микроорганизми и нямат ефект върху други. Например малките концентрации на пеницилин потискат растежа на грам-положителните микроорганизми и не засягат грам-отрицателните.
Първият етап на изолиране на чиста култура
Инокулирайте върху петриеви панички с хранителен агар. За да направите това, материалът за изследване, ако е необходимо, се разрежда със стерилен физиологичен разтвор. Една капка от приготвения разтвор се нанася в примка върху повърхността на хранителната среда в петриево блюдо и старателно се втрива в средата с помощта на шпатула, като равномерно разпределя материала по цялата й повърхност. След засяване чашата се обръща с капачката надолу, етикетира се и се поставя в термостат при 37ºC за 18-24 часа.
Засяването се извършва върху елективна хранителна среда.
Културите се извършват върху диференциално диагностична среда.
Лабораторните животни се заразяват с изследвания материал.
Известни са сравнително малко методи за изолиране на бактерии като чисти култури. Това най-често се прави чрез изолиране на отделни клетки върху твърда културална среда, като се използва методът на посяване на ивици или чрез изливане на малко количество течна култура в блюда ( метод на ограничаване на разреждането). Получаването на отделна колония обаче не винаги гарантира чистотата на културата, тъй като колониите могат да растат не само от отделни клетки, но и от техните клъстери. Ако микроорганизмите образуват слуз, тогава към него често се прикрепват чужди форми. За пречистване е за предпочитане да се използва неселективна среда (NSM), тъй като замърсяващите микроорганизми се развиват по-добре върху нея и се откриват по-лесно.
Получаването на изолирани колонии върху твърда хранителна среда се постига или чрез пресяване на суспензия от микроорганизми със шпатула ( Метод на Кох), или с помощта на бактериологична бримка ( метод на инсулт при изтощение). В резултат на механичното разделяне на клетките на микроорганизма, всяка от тях може да даде началото на изолирана колония от един вид микроб.
Пресяване с шпатула (метод на Кох)произведени в следната последователност:
1) капка обогатителна култура се нанася върху повърхността на хранителната среда в чиния № 1 със стерилна пипета и се разпределя със стерилна шпатула;
2) извадете шпатулата, бързо затворете чашата и прехвърлете шпатулата в чаша № 2, без да я стерилизирате. Симулирайте разпределението на културата по цялата повърхност на средата, като докоснете нейната повърхност със същата страна на шпатулата, която преди това е била използвана за разпределяне на пробата;
3) точно същите действия се извършват в чаша № 3, след което шпатулата се стерилизира;
4) посявките се поставят в термостат и се инкубират при оптимална температура.
След определено време чашите се изваждат от термостата и се изследва развитието на микроорганизмите. Обикновено в чаша № 1 се наблюдава непрекъснат растеж на бактерии, а в следващите чаши се отбелязват колонии.
Примково пресяване (метод на дренажни ивици)включва засяване на бактериологична примка от обогатена култура върху повърхността на агарна среда в петриеви панички. На първия етап серия от успоредни движения се нанасят върху агарната среда с помощта на примка за култура (Фигура 4.2, А). Примката се стерилизира, охлажда се върху неинокулираната част от агарната среда и се правят серия от удари в посока, перпендикулярна на първите (Фигура 4.2, б). След това примката отново се стерилизира, охлажда се и се нанасят удари в посока IN(Фигура 4.2), а след следващата стерилизация - в посока Ж(Фигура 4.2). Чашите се поставят в термостат и резултатите се отчитат след определено време. Обикновено на ударите АИ бголям брой колонии растат (понякога непрекъснат растеж), докато върху ударите INИ Жобразуват се изолирани колонии.
Фигура 4.2 – Схема на ивично пресяване на бактерии за получаване на изолирани колонии
Серийни разреждания в твърда среда- най-простият метод за посяване на плаки, който се състои в това, че след инокулиране на пробата в епруветка със стерилен разтопен и охладен агар, средата се смесва, излива се в петриево блюдо и се оставя да се втвърди. За да получите добре изолирани колонии, пригответе серия от последователни десетократни разреждания и добавете 1 ml проби директно в чашата, добавете 15–20 ml разтопена агарна среда и разбъркайте чрез разклащане на чашата. Понякога отделни колонии се оказват потопени в агар и могат да бъдат отстранени само механично. Също така е лошо, че бактериите прекарват известно време в среда с температура на разтопен агар.
Специални среди.
В бактериологията широко се използват промишлено произведени сухи хранителни среди, които са хигроскопични прахове, съдържащи всички компоненти на средата с изключение на вода. За тяхното приготвяне се използват триптични разграждания на евтини нехранителни продукти (рибни отпадъци, месо и костно брашно, технически казеин). Те са удобни за транспортиране, могат да се съхраняват дълго време, освобождават лабораториите от огромния процес на подготовка на среди и ги доближават до решаването на проблема със стандартизацията на медиите. Медицинската индустрия произвежда сухи среди Ендо, Левин, Плоскирев, бисмутов сулфитен агар, хранителен агар, въглехидрати с индикатор за BP и други.
Термостати
Термостатите се използват за култивиране на микроорганизми.
Термостатът е устройство, което поддържа постоянна температура. Устройството се състои от нагревател, камера, двойни стени, между които циркулира въздух или вода. Температурата се регулира с термостат. Оптималната температура за размножаване на повечето микроорганизми е 37°C.
УРОК 7
ТЕМА: МЕТОДИ ЗА ИЗОЛИРАНЕ НА ЧИСТА КУЛТУРА ОТ АЕРОБИ. СТЪПКИ НА ИЗОЛИРАНЕ НА ЧИСТА КУЛТУРА НА АЕРОБНИ БАКТЕРИИ ЧРЕЗ МЕТОДА НА МЕХАНИЧНА ДИСОЦИАЦИЯ
План на урока
1. Концепцията за "чиста култура" на бактерии
2. Методи за изолиране на чисти култури чрез механично разделяне
3. Биологични методи за изолиране на чисти култури
4. Методи за идентифициране на бактерии
Цел на урока:Да запознае студентите с различни методи за изолиране на чисти култури, да научи как да сеят с цикъл, удари и инжекция
Насоки за демонстрацията
В естествената им среда бактериите се намират в асоциации. За да се определят свойствата на микробите и тяхната роля в развитието на патологичния процес, е необходимо наличието на бактерии под формата на хомогенни популации (чисти култури). Чистата култура е колекция от бактериални индивиди от един и същи вид, отглеждани върху хранителна среда.
Методи за изолиране на чисти култури от аеробни бактерии
Метод на Пастьор Метод на Кох Биологичен Физически
(има историческа (пластинка)
значение)
Химичен метод
Щукевич
Модерен
Засяване с примка Засяване с шпатула
(Метод на Дригалски)
Методи за изолиране на чисти култури:
1. Методите за механично разделяне се основават на отделянето на микроби чрез последователно триене на тестовия материал върху повърхността на агара.
а) Метод на Пастьор - има историческо значение, предвижда последователно разреждане на тестовия материал в течна хранителна среда чрез метода на валцуване
б) Методът на Кох - методът на плочата - се основава на последователно разреждане на тестовия материал с месопептонен агар, последвано от изливане на епруветки с разредения материал в петриеви панички.
в) Метод на Дригалски - при сеитба на богато засят с микрофлора се използват 2-3 чаши за последователна сеитба с шпатула.
г) Засяване с примка в успоредни удари.
2. Биологичните методи се основават на биологичните свойства на патогените.
а) Биологично - инфекция на силно чувствителни животни, при които микробите бързо се размножават и натрупват. В някои случаи този метод е единственият, който позволява да се изолира патогенната култура от болен човек (например с туларемия), в други случаи е по-чувствителен (например изолирането на пневмокок в бели мишки или патоген на туберкулоза при морски свинчета).
б) Химични – основават се на киселинната устойчивост на микобактериите. За да освободите материала от съпътстващата флора, то
третирани с киселинен разтвор. Ще растат само туберкулозни бацили, тъй като киселинноустойчивите микроби умират под въздействието на киселина.
в) Физическият метод се основава на устойчивостта на спорите към топлина. Да се изолира култура от спорообразуващи бактерии от
смеси, материалът се нагрява при 80°C и се инокулира върху хранителна среда. Само споровите бактерии ще растат, тъй като техните спори са останали живи и са дали началото на растеж.
г) Метод на Shchukevich - базиран на високата подвижност на Proteus vulgaris, способен да произвежда пълзящ растеж.
Метод за приготвяне на пластинчат агар
MPA се разтопява на водна баня, след което се охлажда до 50-55°C. Гърлото на бутилката се изгаря в пламъка на спиртна лампа, петриевите панички се отварят така, че гърлото на бутилката да влезе, без да докосва ръбовете на съда, наливат се 10-15 ml MPA, капакът се запушва. затворена, съдът се разклаща, така че средата да се разпредели равномерно, и се оставя на хоризонтална повърхност, докато се втвърди. След изсушаване пластинките с агар се съхраняват на студено.
Цикълна сеитба
С помощта на стерилна охладена примка вземете капка материал, отворете единия ръб на чашата с лявата си ръка, вкарайте примката вътре и направете няколко удара на едно място с примка в противоположния ръб, след това откъснете примката и инокулирайте материала в успоредни удари от единия край на чашата до другия с интервал от 5-6 mm. В началото на сеитбата, когато в примката има много микроби, те ще дадат сливащ се растеж, но с всеки удар има все по-малко и по-малко микроби в примката и те ще останат поединични и ще произвеждат изолирани колонии.
Засяване по метода на Дригалски
Този метод се използва при инокулиране на материал, силно замърсен с микрофлора (гной, изпражнения, храчки). За да сеете по метода на Дригалски, вземете шпатула и няколко чаши (3-4). Шпатула е инструмент, изработен от метална тел или стъклена стрела, извита в триъгълник или L-образна форма. Материалът се въвежда в първата чаша с примка или пипета и се разпределя равномерно с шпатула по повърхността на средата, без да се изгаря, материалът се втрива в хранителната среда във втората чаша и след това; в третата. При такава сеитба първата чаша ще има сливащ се растеж, а изолираните колонии ще растат в следващите чаши.
22. Методи за изолиране на чисти култури от аероби.
Процесът на изолиране на чиста култура може да бъде разделен на няколко етапа.
Първи етап. От изследвания материал се приготвя цитонамазка, оцветява се по Грам или друг метод и се копира под микроскоп. За инокулация тестваният материал, ако е необходимо, се разрежда в епруветка със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид. Една капка от приготвения разтвор се нанася в примка върху повърхността на хранителния агар в петриево блюдо и старателно се втрива в средата с помощта на шпатула, като равномерно разпределя материала по цялата му повърхност. След засяването чашата се обръща с капачката надолу, надписва се и се поставя в термостат при температура 37 °С за 18-24 часа.
Втори етап. Те разглеждат съдовете и изучават изолирани колонии, като обръщат внимание на тяхната форма, размер, консистенция и други характеристики. За да се определи морфологията на клетките и техните тинкториални свойства, се приготвя намазка от част от изследваната колония, оцветява се с Грам и се изследва под микроскоп. За изолиране и натрупване на чиста култура една изолирана колония или няколко различни изолирани колонии се субкултивират в отделни епруветки с наклонен агар или друга хранителна среда. За да направите това, част от колонията се отстранява с примка, без да се докосват съседните колонии.
Трети етап: Отбелязва се моделът на растеж на изолираната чиста култура. Визуално чистата култура се характеризира с равномерен растеж. Микроскопското изследване на оцветена цитонамазка, приготвена от такава култура, разкрива морфологично и тинкториално хомогенни клетки. Въпреки това, в случай на изразен полиморфизъм, присъщ на някои видове бактерии, в намазки от чиста култура, наред с типичните, се откриват и други форми на клетки.
23. Методи за изолиране на чисти култури от анаероби.
Хранителните среди за анаероби трябва да отговарят на следните основни изисквания: 1) да отговарят на хранителните нужди; 2) осигуряват бърз растеж на микроорганизми; 3) да бъдат адекватно намалени
Инокулациите с цел изолиране на анаеробна микрофлора, както спорообразуваща (клостридии), така и неспорообразуваща (вейлонела, бактероиди, пептококи), се извършват при строго анаеробни условия. Първичните инокулации се извършват върху хранителна среда за обогатяване (тиогликолат, Kitta - Tarozzi), след което се субкултивират върху твърда среда: захарен кръвен агар в петриеви панички, във висока колона от захарен хранителен агар или друга среда за получаване на изолирани колонии. След инкубиране на посевите при анаеробни условия се приготвят петна от получените бактериални колонии, оцветяват се микроскопски и след това се субкултивират върху среда Kitt-Tarozzi и агарна среда за изолиране на чиста култура.
При изолиране на спорообразуващи анаеробни бактерии (клостридии) първоначалните инокулации се нагряват във водна баня при температура 80 °C в продължение на 20 минути, за да се унищожат вегетативните клетки от чужда микрофлора, която може да присъства в тестовия материал.
24. Идентификация на микроорганизми морфологична, културна, серологична, биологична, генетична.
Идентификацията е определяне на систематична позиция, отделяне от всеки източник до ниво вид или вариант.
25. Биохимичен метод за идентификация: определяне на протеолитични. захаролитични, липолитични свойства, идентифициране на хемолизини и оксидоредуктази. Използване на автоматични микробиологични анализатори .
Този метод включва изследване на ензимното разграждане на различни субстрати (въглехидрати, аминокиселини и протеини, урея, водороден пероксид и др.) с образуването на междинни и крайни
продукти.
Карбохидрази- ензими, които разграждат въглехидратите. Чрез определяне на карбохидрази, т.нар захаролитични свойства на микробите. За тази цел се използват следните медии:
а) Хис среда (течна и полутечна с индикатори). Като последното се използва реактив на Андреде, бромотимолово синьо или BP, което се оценява по промяната на цвета на средата и образуването на газ;
б) диференциално диагностични среди с лактоза (Endo, Levina, Ploskireva и др.);
в) поливъглехидратни среди (като Olkenitsky, Kligler и др.).
Протеази- ензими, които разграждат протеини:
а) изследваната култура може да разгражда субстратните протеини с образуването на пептон, албумин и аминокиселини. Този процес се осъществява благодарение на ензимите протеинази и пептидази. За да се идентифицират тези ензими, изследваната култура се инокулира върху редица среди: съсирен серум, колона от желатин (втечняване в положителни случаи), млечен агар в петриево блюдо (в положителни случаи около колониите се появяват мътни зони);
б) разграждането на аминокиселините от микробите може да стане чрез декарбоксилиране или дезаминиране. В първия случай амините се образуват от една или друга аминокиселина, които се откриват или чрез електрофореза. или чрез алкализиране на средата. Наличието на деаминази в микроба се съди по образуването на амоняк в средата в резултат на процеса на дезаминиране на аминокиселини;
в) разграждането на аминокиселината триптафан поради действието на ензима триптафаназа се придружава от образуването на индол. Последният се открива с помощта на лист хартия, навлажнен с оксалова киселина и фиксиран под запушалка над хранителната среда. В положителни случаи листът става червен;
г) за идентифициране на ензими за разграждане на съдържащи сяра аминокиселини (цистин, цистеин) се провеждат тестове за H2S, като продукт на разграждането на тези аминокиселини от десулфурази. Наличието на H2S също се открива в околната среда на Olkenitsky;
д) за идентифициране на уреаза, ензим, който разгражда уреята, урея и индикатор се добавят към хранителната среда при неутрално рН. В положителни случаи средата променя цвета си поради изместване на рН към алкалната страна поради образуването на амоняк. Липази- ензими за разграждане на липиди и липоиди. Най-често лецитиназата се определя чрез посяване върху жълтъчен агар. Лецитиназата разгражда лецитина до фосфохолин и диглицерид. В тези случаи, когато колониите растат, около тях се появяват опалесциращи зони, отразяващи лецитиназната активност.
Токсинни ензими : Хемолизините са ензими, които разграждат фосфолипидната мембрана на еритроцитите. Откриват се чрез посяване на културата върху кръвен агар (5-10%). Има b-хемолиза или пълна хемолиза, когато около колониите се образуват очистващи зони, a-хемолиза, непълна хемолиза, когато около колониите има зелени зони. Липсата на хемолиза се нарича d-хемолиза.
Цитотоксини- ензими, които имат токсичен ефект върху целевите клетки. Например, цитотоксичността на токсина на анаеробните микроорганизми се определя в клетъчна култура. За целта 1 g материал (изпражнения или др.) се разрежда във фосфатен буфер 1:10 маса/обем, центрофугира се 30 min при 4000 rpm. Супернатантата се филтрира през 20 nm филтър, добавя се към монослой от клетъчна култура на McCoy и се инкубира при 37°C в продължение на 24-48 часа до постигане на токсичен ефект.
Имунохимично определяне на производството на токсини: като правило се използва ензимен имуносорбентен метод за определяне на много екзотоксини - дифтериен, холерен, стафилококов и др. За тази цел се използват тест системи на базата на моноклонални антитела към специфичен екзотоксин.
Пасмокоагулаза- ензим, който коагулира кръвната плазма на животните. Определя се в реакция от епруветка. В 1 мл заешка или човешка цитратна плазма (цяла или разредена 2 и 4 пъти с физиологичен разтвор) се разбърква бримка от дневна агарна култура на микроба. Сместа се инкубира в термостат при 37°С. В положителни случаи след 2-4 часа плазмата коагулира (появява се съсирек). Лецитиназа - виж по-горе.
Оксидни редуктази:
1. Определение оксидази. Ленти от тестовата култура се поставят в примка върху филтърна хартия, навлажнена с 1% разтвор на тетраметилпарафенилендиамин. При положителен случай се появява виолетово оцветяване на ивиците (в рамките на 1 минута).
2. Определяне на каталаза. Капка от 3% разтвор на водороден прекис се нанася върху предметно стъкло и там се въвежда бримка от тестовата култура. В присъствието на каталаза се образуват кислородни мехурчета.
3. Определяне на дехидрази. За наличието на дехидрази се съди по редуциращата способност на микроба, т.е. способност за намаляване на някои органични багрила (например 1% воден разтвор на метиленово синьо). Багрило (акцептор на водород) се добавя към колона от захарен агар (донор на водород) и микробната култура се инокулира с инжекция. В положителни случаи микробът, който расте върху такава среда, я обезцветява.
4. Определяне на спектъра на късоверижни мастни киселини (SCFA),Анаеробните микроорганизми произвеждат междинни продукти, включително късоверижни мастни киселини и алкохоли, чийто спектър (профил) е различен при различните видове микроорганизми и позволява идентифициране на микроорганизмите до родово ниво. Най-често тествани са оцетна, пропионова, бутилова, изобутилова, валерианова, изовалерианова, капронова и изокапронова киселина. За определяне на SCFA се използва методът на газово-течна хроматография. Идентифицирани са микроорганизми като актиномицети, пролионибактерии, еубактерии, бифидобактерии и клостридии.
През последните години бактериологичните лаборатории използват търговски тестови системи за бърза биохимична идентификация (определяне на биохимичната активност на различни групи микроорганизми): например 2O тестове за ентеробактерии и ZO тестове за анаероби. Схемата за идентификация включва следните стъпки:
Колонии ---- Подготовка ---- Приложение ----- Инкубация ---- Отчитане (+ -) ---- Интер-
суспензии суспензии 4 часа 37°C представяне в сряда
Като идентификационен материал се използва добре изолирана колония върху блюдо или чиста култура в епруветка, от която се приготвя суспензия с концентрация на стандарта за оптична плътност N4, след което се добавят 55 μl от суспензията в ямките. с носителя на тази тестова система. Плаката с лентите се инкубира при 37°С в продължение на 4 часа. Отчитането може да се извърши автоматично (с помощта на устройството ATV) или визуално. Резултатът от биохимичната реакция се оценява под формата на „+“ или „-“ и се въвежда референтна таблица, в която положителният резултат съответства на цифров израз. , което води до определен цифров профил, съответстващ на специално разработен индекс на аналитичен профил, който ви позволява бързо да идентифицирате един или друг
микроорганизъм.